Au fost cunoscute secvențele genomice ale majorității virusurilor.Sonde de acid nucleic care sunt segmente scurte de ADN concepute pentru a hibridiza cu ADN viral sau segmente de ARN complementare.Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este o tehnică mai eficientă pentru detectarea virală.Metode de diagnosticare cu randament ridicat au fost dezvoltate recent.
A. Tehnica de hibridizare a acidului nucleic
Hibridizarea acidului nucleic, incluzând în principal Southern blotting (Southern) și Northern blotting (Northern), este o nouă tehnică în dezvoltare rapidă în domeniul diagnosticului de virus.Motivul testului de hibridizare este de a utiliza segmente scurte de ADN (numite „sondă”) concepute pentru a hibridiza cu ADN viral sau segmente de ARN complementare.Prin încălzire sau tratament alcalin, ADN-ul sau ARN-ul țintă dublu catenar sunt separati în catene simple și apoi sunt imobilizați pe un suport solid.După aceea, sonda este adăugată și hibridizată cu ADN-ul sau ARN-ul țintă.Deoarece sonda este marcată cu izotop sau nuclid neradioactiv, ADN-ul sau ARN-ul țintă poate fi detectat prin autoradiografie sau prin sistemul biotină-avidină.Deoarece majoritatea genomilor virali au fost donați și secvențiați, aceștia pot fi detectați folosind secvențe specifice virusului ca sonde în specimen.În prezent, metodele de hibridizare includ: dot blot, hibridizare in situ în celule, DNA blot (ADN) (Southern blot) și ARN blot (ARN) (Northern blot).
B. Tehnologia PCR
În ultimii ani, au fost dezvoltate o serie de tehnici in vitro de amplificare a acidului nucleic bazate pe PCR, pentru a testa virusuri insensibile sau necultivabile.PCR este o metodă care poate sintetiza secvență specifică de ADN prin reacția polimerazei in vitro.Procesul de PCR include un ciclu termic de trei etape: denaturare, recoacere și extindere La temperatură ridicată (93℃~95℃), ADN-ul dublu catenar este separat în două catene simple de ADN;apoi la temperatură scăzută (37℃~60℃), doi primeri nucleotidici sintetizați se recoacă la segmentele complementare de ADN;în timp ce la temperatura corespunzătoare pentru enzima Taq (72 ℃), sinteza noilor lanțuri de ADN începe de la capătul primerului 3, folosind ADN complementar ca șablon și nucleotide individuale ca materiale.Deci, după fiecare ciclu, un lanț de ADN poate fi amplificat în două lanțuri.Repetând acest proces, fiecare lanț de ADN sintetizat într-un ciclu poate fi folosit ca șablon în ciclul următor, iar numărul de lanțuri de ADN este dublat în fiecare ciclu, ceea ce înseamnă că producția de PCR este amplificată cu o viteză de 2n log.După 25 până la 30 de cicluri, producția de PCR este identificată prin electroforeză, iar produșii specifici ADN pot fi observați sub lumină UV (254 nm).Pentru avantajul său de specificitate, sensibilitate și comoditate, PCR a fost adoptată în diagnosticul clinic al multor infecții virale, cum ar fi HCV, HIV, CMV și HPV.Deoarece PCR este foarte sensibilă, poate detecta ADN-ul virusului la nivel de fg, operația trebuie efectuată cu mare atenție pentru a evita falsul pozitiv.În plus, rezultatul pozitiv al testului de acid nucleic nu înseamnă că există virus infecțios viu în probă.
Cu aplicarea largă a tehnicii PCR, sunt dezvoltate noi tehnici și metode bazate pe tehnica PCR pentru diferite scopuri de testare.De exemplu, PCR-ul cantitativ în timp real poate detecta încărcătura virală;PCR in situ este utilizată pentru a identifica infecția cu virus în țesut sau celule;PCR imbricată poate crește specificitatea PCR.Printre acestea, PCR cantitativ în timp real a fost dezvoltat mai rapid.Multe tehnici noi, cum ar fi sonda de hidroliză TaqMan, sonda de hibridizare și sonda far moleculară, au fost combinate în tehnica PCR cantitativă în timp real, care este utilizată pe scară largă în cercetarea clinică.Pe lângă identificarea cu precizie a încărcăturii virale din fluidul corporal al pacienților, această metodă poate fi folosită și pentru a detecta mutanții toleranți la medicamente.Prin urmare, PCR cantitativă în timp real este aplicată în principal în evaluarea efectului curativ și în supravegherea toleranței la medicamente.
C. Detectarea cu randament mare a acizilor nucleici virali
Pentru a satisface nevoile de diagnosticare rapidă a noilor boli infecțioase emergente, au fost stabilite diverse metode de detectare cu randament ridicat, cum ar fi cipurile ADN (ADN).Pentru cipurile ADN, sondele specifice sunt sintetizate și atașate la cipuri mici de siliciu cu densitate foarte mare pentru a forma microarray de sonde ADN (ADN) care poate fi hibridizată cu proba.Semnalul de hibridizare poate fi vizualizat cu un microscop confocal sau cu un scaner cu laser și poate fi procesat în continuare de computer și se poate obține un set uriaș de date referitoare la diferite gene.Există două tipuri de cip ADN.„Cipul de sinteză” este după cum urmează: oligonucleotidele specifice sunt sintetizate direct pe cipuri.Un altul este cipul ADN-ului.Genele clonate sau produsele PCR sunt imprimate ordonat pe diapozitiv.Avantajul tehnologiei cipului ADN este detectarea simultană a unei cantități uriașe de secvențe ADN.Cea mai recentă versiune a cipului de detectare a agenților patogeni poate identifica peste 1700 de viruși umani simultan.Tehnologia cipurilor ADN a rezolvat problemele metodelor tradiționale de hibridizare a acidului nucleic și are aplicații foarte largi în diagnosticul viral și studiul epidemiologic.
Ora postării: 23-dec-2020